前言

       补料工艺的优化是发酵工艺优化最重要的研究方向之一，持续而又稳定的补料速率往往对最终产物的合成和菌株的代谢方向影响较大。多数产物的合成在补料过程中需要严格将培养基中的糖控制在一定浓度。传统的控糖主要依靠操作人员不断地取样检测与手动调节补料速度，时效性较差，调控效果也较差。发酵工程师们也始终在寻找着更稳定，更精确的控糖方式。本案例以色氨酸生产菌株E. coli TM01为出发菌株，采用赛多利斯（7 L）平行生物反应器，分别通过手动控糖和生物培养过程在线检测仪（BODS）的自动检测控糖策略两种不同方式维持培养基中葡萄糖浓度，以色氨酸产量为指标来对比不同控糖模式的差异。

图1 天木生物生物培养过程在线检测仪（BODS）

实验过程

       实验菌种：E. coli WT01。

       种子液培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，葡萄糖20 g/L；

发酵液培养基：葡萄糖25 g/L，酵母提取物7 g/L，一水合柠檬酸1.1 g/L，硫酸铵7.5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，三水合磷酸氢二钾3 g/L，七水合硫酸镁1 g/L，七水合硫酸铁0.1 g/L，维生素B1 0.1g/L，甘油10 g/L，抗坏血酸 0.45 g/L，摇瓶发酵额外加入碳酸钙5 g/L；

       发酵罐发酵培养：取甘油管中菌种活化后转接至种子培养液37℃培养12 h后，按5%接种量转接至发酵培养基。发酵过程在赛多利斯7L发酵罐中进行，通气量为1vvm，通过溶氧关联搅拌转速将溶氧控制在30%，通过流加氨水将pH维持在6.9。37℃培养至OD600到10左右后，降温至30℃并加入IPTG诱导。发酵过程中当培养基中的葡萄糖消耗完毕后，流加500 g/L的葡萄糖溶液将残糖浓度控制在 2 g/L。

       手动补料组每1 h取样检测培养基中残糖浓度，并根据所测浓度手动调整补料策略。自动补料组使用天木生物的生物培养过程在线检测仪（BODS）实时检测培养基中残糖浓度，并由仪器自动调整补糖策略。发酵液中色氨酸浓度由液相进行检测对比。

实验结果

       如图2所示，在手动补料模式下，由于无法实时观察菌体的生长情况，培养基中残糖浓度波动较大，而且由于夜间操作人员疲劳，误差最大时甚至达到了+10 g/L的差异。残糖浓度的波动直接影响了菌体的生物量和色氨酸产量，手动控糖组色氨酸产量最高时仅有约0.3 g/L。而与之相比，BODS的智能关联补料完全摒弃了人为操作带来的误差，可以全天候实时监控发酵液中菌体的生长情况、检测培养基中残糖浓度（案例中设置为1 h自动取样并检测一次）并反馈给系统，然后根据设置值实时调整补料策略使糖稳定的维持在设定值（2±0.2g/L），更好的控糖策略也带来了色氨酸产量的大幅度增加，与手动补料模式相比，BODS智能关联补料模式下色氨酸产量提高了约71.4%。

图2 手动补料和智能关联补料发酵结果对比

结论

       本案例以产色氨酸工程菌株为出发菌株，研究了不同补料策略下对菌株色氨酸产量的影响。实验结果证明：更稳定的控糖方式往往会带来产量大幅度的增加。与手动补料模式相对比，BODS智能关联系统在无操作人员的情况下通过自动取样检测、监控、反馈调节、自主学习补料策略等方式将培养基中残糖水平稳定的控制在了设定值（2±0.2g/L），也使菌株的色氨酸产量提高约71.4%，这说明了BODS在发酵工艺优化中的重要作用。除此之外，在工业化生产中残糖浓度的控制也是直接影响企业产品质量的关键参数，BODS的实时检测能力也有助于生产车间人员实时掌控发酵过程变化，及时调整工艺参数，帮助企业更好的完成产物的放大生产。

       自成立伊始，天木生物恪守客户至上的原则，致力于提供高度专业化的菌种优化方案，为发酵过程优化提供更多可靠选择。