本期为您推荐贵州大学生命科学院李祝教授课题组在基于微流控技术的高通量筛选方面相关的工作。该课题组通过液滴微流控平台筛选拮抗菌，与传统的琼脂平板筛选方法相比，筛选效率提高了约3000倍。筛选得到的突变体，其抑菌活性较野生型菌株提高了62%。

图1 拮抗菌的高通量筛选流程

       软腐病是一种严重影响农作物的细菌性植物病害，主要由软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora）引起，发生在蔬菜和观赏植物的肉质储存组织中。这种病害可以迅速在植物体内扩散，造成组织水解、腐烂，最终导致作物减产甚至全军覆没，从而给农业生产带来巨大的经济损失，并成为限制农业可持续发展的重要因素之一。

       随着现代生物技术的快速发展，生物防治因具有生物防治效果好，无毒无害，无污染等特点越来越来受到人们的重视。农用抗生素（生物活性物质）、拮抗微生物等在病虫害防治研究中得到了较好的应用。传统的拮抗菌筛选通常采用琼脂平板法进行的分离和筛选，具有高劳动强度、高成本和低效率的限制因素，显著影响拮抗菌的筛选和应用。随着液滴微流控技术的发展，利用其高通量的特性构建新的筛选平台—DREM Cell，显著提高筛选效率的同时大幅降低了成本。

       研究人员采集来自贵州省毕节市某魔芋种植区表面10 cm下的土壤样本，分别采用液滴体系与培养皿体系进行微生物资源探查。镜检结果显示含菌液滴数量约占总液滴数量的12.22%，液滴中菌落数与平板数量基本一致，表明菌株在液滴中的生长与平板培养具有相当水平（图2）。对不同培养条件下得到的菌落进行分析发现，液滴培养样品中95%以上的OTU属于稀有生物圈，其相对丰度在原始土壤样品中低于0.01%（图3），这表明液滴培养在揭示复杂微生物群落中罕见生物圈方面具有巨大潜力。

图2 液滴生成和培养液滴样品的显微镜图像

图3 不同培养样品的扩增子测序结果比较

       利用GFP-Ecc15菌株作为报告菌，拮抗菌可以抑制报告菌株的生长，从而显著降低体系的荧光值（图4，5）。在拮抗菌B. velezensis 和非拮抗菌E. coli 混合体系的富集筛选中验证了筛选体系的适用性，建立拮抗菌的高通量筛选模型。拮抗菌的最大富集效率达到226倍，三次重复实验拮抗菌的平均富集效率提高148倍。结果说明，基于液滴微流控的筛选模型能够很好地将对报告菌株具有抑制作用的细菌分离出来。

图4 GFP-Ecc15在液滴中的生长情况

图5 拮抗菌与非拮抗菌对GFP-Ecc15荧光值的影响

       最后基于该高通量模型，对土壤环境复杂样本进行拮抗菌株的筛选。以每小时105个细胞速率进行分选，分选后的液滴涂布至平板，选取单菌落通过琼脂扩散法验证其对病原指示菌Ecc15的抑菌能力。经过筛选，32株具有抗菌活性的细菌被富集，其中最佳菌株的抑菌直径达到20.86±1.56 mm。经过ARTP诱变，抑菌直径进一步扩大至26.15±0.29 mm，显著大于出发菌株的18.31±0.64 mm（图6），抑菌活性提升62%。

图6 高活性突变体与野生型抑菌圈差异

       本研究将液滴微流控技术与ARTP诱变结合，利用DREM Cell平台开展高通量拮抗菌筛选工作，进行环境微生物资源挖掘、复杂样本拮抗菌株筛选以及菌株突变库筛选工作。相较于传统方法，培养基的试剂消耗降低至1.2×107分之一，筛选速率提升3000多倍，成功从土壤样品中筛选并诱变得到高效的拮抗菌。该平台为拮抗菌的筛选提供了一种更高效和成本更低的解决方案，为农业生物防治提供了一个全新的视角，对于深入理解和利用隐藏于微小土壤颗粒中的生物资源有重要意义。

论文DOI：10.27047/d.cnki.ggudu.2023.001995